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El análisis de los eventos de fosforilación de todo el proteoma sigue siendo un desafío analítico importante debido a la enorme complejidad de las redes de fosforilación de proteínas.En este trabajo evaluamos la complementariedad de Lys-N, Lys-C y tripsina con respecto a su capacidad para contribuir al análisis global del fosfoproteoma.Se usó una versión refinada de intercambio catiónico fuerte de pH bajo para separar de manera eficiente los péptidos no modificados, fosforilados y acetilados en el extremo N.Se pudo identificar un total de 5036 fosfopéptidos no redundantes con una tasa de descubrimiento falso de <1 % a partir de 1 mg de proteína usando una combinación de las tres enzimas.Nuestros datos revelaron que la superposición entre los conjuntos de datos de fosfopéptidos generados con diferentes proteasas fue marginal, mientras que la superposición entre dos conjuntos de datos trípticos generados de manera similar resultó ser al menos 4 veces mayor.De esta manera, el uso paralelo de Lys-N y tripsina permitió un aumento del 72 % en el número de fosfopéptidos detectados en comparación con la tripsina sola, mientras que un experimento de réplica de tripsina solo condujo a un aumento del 25 %.Por lo tanto, cuando nos enfocamos únicamente en los datos de tripsina y Lys-N, identificamos 4671 fosfopéptidos no redundantes.El análisis adicional de los sitios detectados mostró que los conjuntos de datos de Lys-N y tripsina se enriquecieron en motivos de fosforilación significativamente diferentes, lo que demuestra aún más que los enfoques multiproteasa son muy valiosos en los análisis de fosfoproteomas.