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La utilización mejorada de nitrógeno en el ganado es importante para asegurar una producción ganadera sostenible.Como las purinas y las pirimidinas (PP) constituyen una parte apreciable del nitrógeno ruminal, es esencial comprender mejor la absorción y el metabolismo intermediario de las PP.El presente trabajo describe el desarrollo y validación de un método sensible y específico para la determinación simultánea de 20 purinas (adenina, guanina, guanosina, inosina, 2'-desoxiguanosina, 2'-desoxiinosina, xantina, hipoxantina), pirimidinas (citosina, timina, uracilo, citidina, uridina, timidina, 2'-desoxiuridina) y sus productos de degradación (ácido úrico, alantoína, β-alanina, ácido β-ureidopropiónico, ácido β-aminoisobutírico) en plasma sanguíneo de vacas lecheras.La técnica basada en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (LC-MS/MS) se combinó con estándares de calibración emparejados con matriz individual y compuestos de referencia marcados isotópicamente estables.El análisis cuantitativo fue precedido por un novedoso procedimiento de pretratamiento que consiste en precipitación, filtración, evaporación y reconstitución con etanol.Se investigaron los parámetros de separación y detección durante el análisis LC-MS/MS.Se confirmó que el uso de un modelo de calibración logarítmica en lugar de un modelo de calibración lineal dio como resultado un % de CV más bajo y la falta de prueba de ajuste demostró una regresión lineal satisfactoria.El método cubre rangos de concentración para cada metabolito de acuerdo con las muestras reales, por ejemplo, guanina: 0,10-5,0 μmol/L y alantoína: 120-500 μmol/L.El CV% para los rangos de cuantificación elegidos estuvo por debajo del 25%.El método tiene buena repetibilidad (CV%≤25%) y precisión intermedia (CV%≤25%) y excelentes recuperaciones (91-107%).Todos los metabolitos demostraron una buena estabilidad a largo plazo y una buena estabilidad dentro de las series (CV%≤10%).Se observaron diferentes grados de efectos de matriz absoluta en plasma, orina y leche.La determinación de los efectos de la matriz relativa reveló que el método era adecuado para casi todos los metabolitos de PP examinados en plasma extraído de una arteria y de las venas hepática portal, hepática y gastroesplénica y, con algunas excepciones, también para otras especies como pollo, cerdo, visón, humano y rata.