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Nuevo ensayo de cromatografía líquida de alta resolución para glicosiltransferasas basado en derivatización con ácido antranílico y detección de fluorescencia.

Los ensayos se desarrollaron utilizando la química de marcado única del ácido 2-aminobenzoico (2AA; ácido antranílico, AA) para medir las actividades de la β1-4 galactosiltransferasa (GalT-1) y la α2-6 sialiltransferasa (ST-6) mediante líquidos de alto rendimiento. cromatografía (HPLC) con detección de fluorescencia (Anumula KR. 2006. Avances en métodos de derivatización de fluorescencia para el análisis cromatográfico líquido de alto rendimiento de carbohidratos de glicoproteína. Anal Biochem. 350:1-23).Se utilizaron N-acetilglucosamina (GlcNAc) y N-acetillactosamina como aceptores y uridina difosfato (UDP)-galactosa y citidina monofosfato (CMP)-ácido N-acetilneuramínico (NANA) como donantes para GalT-1 y ST-6, respectivamente.Los productos enzimáticos se marcaron in situ con AA y se separaron de los sustratos en la columna TSKgel Amide 80 usando condiciones de fase normal.Las unidades de enzima se determinaron a partir de las áreas de los picos por comparación con los estándares derivatizados concomitantemente Gal-β1-4GlcNAc y NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Se establecieron la linealidad (tiempo y concentración de enzima), la precisión (intraensayo e interensayo) y la reproducibilidad de los ensayos.Se encontró que los ensayos eran útiles para monitorear las actividades enzimáticas durante el aislamiento y la purificación.Los ensayos fueron muy sensibles y se desempeñaron igual o mejor que las mediciones tradicionales basadas en azúcar radiactivo.El formato de ensayo también se puede usar para medir la actividad de otras transferasas, siempre que los aceptores de carbohidratos contengan un extremo reductor para marcar.Se desarrolló un ensayo para aceptores de glicoproteínas usando IgG.Se desarrolló un método de perfilado de HPLC corto para la separación de glucanos IgG (biantenario G0, G1, G2, mono- y disialilados), lo que facilitó la determinación de las actividades de GalT-1 y ST-6 de manera rápida.Además, este método de creación de perfiles debería resultar útil para controlar los cambios en los glucanos de IgG en entornos clínicos.