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Para cuantificar específicamente varios metabolitos de 5-fluorouracilo (5-FU) y dos nucleótidos monofosfato endógenos, desarrollamos un método original basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).Este ensayo permitió determinar: (i) la producción intracelular de 5-fluoro-2′-desoxiuridina-5′-monofosfato (5-FdUMP) a partir de 5-FU o 5-fluoro-2′-desoxiuridina (5-FdUrd) , (ii) el impacto de la concentración de 5-FdUMP en la proporción intracelular de 2′-desoxiuridina-5′-monofosfato (dUMP)/timidina-5′-monofosfato (TMP), y (iii) el grado de secreción de 5-FdUMP y 5-FU de células humanas cultivadas por transportadores ABC.En nuestras condiciones experimentales, las células se incubaron con 5-FU o 5-FUrd.Luego, las proteínas celulares se precipitaron con metanol.Este procedimiento proporcionó una alta recuperación de extracción.Además, para medir la secreción de 5-FU y 5-FdUMP de las células, llevamos a cabo la cuantificación de estas moléculas en medio de cultivo.Los medios se inyectaron directamente (5-FU) o se sometieron a una extracción en fase sólida utilizando el cartucho de extracción Oasis Wax (5-FdUMP).La separación de los analitos se realizó en una columna dC18 Atlantis de 3,5 μm (100 mm × 2,1 mm de d.i.) con modo isocrático utilizando tampón de formato de amonio/metanol/agua (5/5/90, v/v) como fase móvil.El tiempo de ejecución no superó los 6,2 min.Los analitos se ionizaron en una interfaz de electropulverización en modo de iones negativos.Validamos el método en un rango de 2,5 a 150 ng mL-1 según los compuestos.La variabilidad intraensayo e interensayo fue inferior al 10 % durante siete días.Todos los compuestos fueron estables en las células o en el medio de cultivo cuando las muestras se almacenaron a -20 °C durante al menos dos semanas y después de tres ciclos de congelación y descongelación.No se observó efecto matriz en ambos medios.