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La fosforilación de proteínas regula diversas funciones celulares y juega un papel clave en el desarrollo temprano de las plantas.Para complementar y ampliar investigaciones previas sobre la fosforilación de proteínas en plántulas de Arabidopsis, utilizamos un enfoque alternativo que combina la extracción de proteínas en condiciones no desnaturalizantes con cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) enriquecimiento de fosfoproteínas intactas en extractos agotados de Rubisco, seguido de identificación utilizando electroforesis en gel bidimensional (2-DE) y cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).La digestión con tripsina en gel y el análisis de puntos de gel seleccionados identificaron 144 péptidos y residuos fosforilados, de los cuales solo 18 fosfopéptidos y 8 fosfositos se encontraron en las bases de datos de sitios de fosforilación de PhosPhAt 4.0 y P3DB Arabidopsis thaliana.Más de la mitad de las 82 fosfoproteínas identificadas estaban involucradas en el metabolismo de los carbohidratos, la fotosíntesis/respiración o los mecanismos de respuesta al estrés oxidativo.El enriquecimiento de fosfoproteínas intactas antes de 2-DE y LC-MS/MS parece mejorar la detección de residuos de treonina y tirosina fosforilados en comparación con los métodos que utilizan el enriquecimiento a nivel de péptido, lo que sugiere que los dos enfoques son algo complementarios en términos de cobertura del sitio de fosforilación.Al comparar los resultados de plántulas jóvenes con los obtenidos previamente para hojas maduras de Arabidopsis, se identificaron cinco proteínas que se fosforilan de manera diferencial en estos tejidos, lo que demuestra el potencial de esta técnica para investigar la dinámica de la fosforilación de proteínas durante el desarrollo de la planta.