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La indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO1) y el triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) son dos enzimas estructuralmente diferentes que tienen una distribución tisular y funciones fisiológicas diferentes, pero ambas catalizan la conversión de triptófano en N-formilquinurenina (NFK).IDO1 ha sido validado clínicamente como un objetivo de fármaco de molécula pequeña para el cáncer, mientras que los estudios preclínicos indican que TDO puede ser un objetivo para la inmunoterapia contra el cáncer y la enfermedad neurodegenerativa.Hemos desarrollado un ensayo de detección de alto rendimiento para IDO1 y TDO basado en una nueva sonda química, NFK Green, que reacciona específicamente con NFK para formar una molécula verde fluorescente con una longitud de onda de excitación de 400 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm.Proporcionamos la primera comparación lado a lado de varios inhibidores publicados de IDO1 y TDO y revelamos que el inhibidor preclínico de IDO1, el Compuesto 5l, muestra una reactividad cruzada significativa con TDO, mientras que se confirmó la selectividad relativa de otros inhibidores publicados.La idoneidad para el cribado de alto rendimiento de los ensayos se demostró mediante el cribado de una biblioteca de 87.000 sustancias químicas en formato de 384 o 1536 pocillos.Finalmente, demostramos que el ensayo también se puede utilizar para medir la capacidad de las células para metabolizar el triptófano y para medir la potencia celular de los inhibidores de IDO1 y TDO.