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Uno de los factores que impiden la aplicación clínica de la medicina regenerativa a las enfermedades degenerativas del cartílago es una fuente adecuada de células.Los condrocitos, el único tipo celular de cartílago, cultivados in vitro en condiciones de cultivo para aumentar el número de células, pierden su fenotipo junto con la capacidad de generar tejido cartilaginoso hialino.En este estudio, determinamos que un sistema de cultivo tridimensional (3D) libre de suero y factor de crecimiento restaura la capacidad de los condrocitos sometidos a pases para formar tejido cartilaginoso in vitro, un proceso que implica sox9. permiten la expansión del número de células (P2) y se cultivan a alta densidad en membranas recubiertas de colágeno tipo II 3D en medios con alto contenido de glucosa complementados con insulina y dexametasona (SF3D).Las células se caracterizaron después de la expansión de la monocapa y después del cultivo en 3D mediante citometría de flujo, expresión génica e histología.Se caracterizaron los primeros cambios en las vías de transducción de señalización durante la rediferenciación. Las células P2 mostraron un perfil de antígeno similar a un progenitor de 99 % CD44 (+) y 40 % CD105 (+) y un perfil de expresión génica sugestivo de células interzonales.P2 en SF3D expresó genes condrogénicos y matriz extracelular acumulada.La regulación negativa del receptor de insulina (IR) con HNMPA-(AM3) o la vía de la cinasa PI-3/AKT (activada por el tratamiento con insulina) con Wortmannin inhibió la síntesis de colágeno.HNMPA-(AM3) redujo la expresión de los genes Col2, Col11 e IR, así como Sox6 y -9.Los análisis de co-inmunoprecipitación e inmunoprecipitación de cromatina de células tratadas con HNMPA-(AM3) mostraron la unión de los coactivadores Sox6 y Med12 con Sox9 pero redujeron la unión de Sox9-Col2a1. Describimos un nuevo método de cultivo que permite aumentar el número de condrocitos y promueve Formación de tejido de cartílago similar a hialino en parte por unión de Sox9-Col2a1 mediada por insulina.La idoneidad del tejido generado a través de este enfoque para su uso en la reparación de articulaciones debe examinarse in vivo.