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La forma en que los efectos de mutaciones simultáneas se combinan para cambiar la actividad enzimática no es fácilmente predecible porque estos efectos no siempre son aditivos de manera lineal.Por lo tanto, la caracterización de los efectos de mutaciones simultáneas de residuos de aminoácidos que se unen al sustrato puede contribuir de manera significativa a la comprensión de la especificidad de sustrato de las enzimas.En la beta-glucosidasa de Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), ambos residuos Q39 y E451 interactúan con el sustrato y esto es esencial para definir la especificidad del sustrato.Se prepararon mutantes dobles de Sfbetagly (A451E39, S451E39 y S451N39) mediante mutagénesis dirigida, se expresaron en bacterias y se purificaron mediante cromatografía de afinidad.Estas enzimas se caracterizaron utilizando p-nitrofenil beta-galactósido y p-nitrofenil beta-fucósido como sustratos.La relación k cat/Km para mutantes simples y dobles de Sfbetagly que contienen mutaciones dirigidas al sitio en las posiciones Q39 y E451 se usó para demostrar que el efecto sobre la energía libre de ESdoble daga (complejo de estado de transición enzimático) de las mutaciones dobles (Gdouble daggerxy) no es la suma de los efectos resultantes de las mutaciones individuales (Gdouble daggerx y Gdouble daggery).Esta diferencia en Gdoble daga indica que los efectos de las mutaciones individuales se superponen parcialmente.Por lo tanto, este efecto común cuenta solo una vez en Gdoble daga.Los datos cristalográficos de las beta-glucosidasas revelan la presencia de un enlace de hidrógeno bidentado que involucra los residuos Q39 y E451 y el mismo grupo hidroxilo del sustrato.Por lo tanto, tanto los datos termodinámicos como cristalográficos sugieren que los residuos Q39 y E451 ejercen una influencia mutua en sus respectivas interacciones con el sustrato.